Séquenceur d'ADN

Un séquenceur de gènes est un appareil capable d'automatiser l'opération de séquençage de l'ADN. Un séquenceur sert à déterminer l'ordre des bases nucléiques d'un échantillon d'ADN et à le présenter, après traitement, sous forme d'une suite de lettres, appelée read ou lecture, représentant des nucléotides. Les grands projets de séquençage, tels ceux de déchiffrage de génomes entiers, ne sont concevables que s'il existe des appareils permettant d'augmenter la productivité des agents humains. On peut considérer certains séquenceurs comme des appareils optiques, vu qu'ils analysent les signaux lumineux émis par des fluorochromes fixés aux nucléotides.

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Plusieurs séquenceurs d'ADN

Le principe de la réaction de séquençage utilisée dans les séquenceurs est dérivé de celui de la méthode de Sanger. Il se fonde toujours sur l'utilisation de di-désoxy-nucléotides (dd-NTP), mais peaufiné par l'utilisation de marqueurs fluorescents à la place de marqueurs radioactifs.

Les instruments les plus modernes de séquençage automatique de l'ADN sont capables de lire jusqu'à 384 échantillons marqués à la fluorescence d'un coup (run) et réaliser jusqu'à 24 runs en une journée. Ces instruments n'effectuent que la séparation des brins et la lecture des pics ; les réactions de séquençage, la purification et la resuspension dans un tampon approprié doivent se faire séparément, le plus souvent à la main.

La magnitude du signal de fluorescence est liée au nombre de brins d'ADN présents dans la réaction. Si la quantité initiale d'ADN est petite, le signal sera faible. Cependant, les propriétés de la PCR permettent d'augmenter le signal en augmentant le nombre de cycles dans le programme de la PCR.

Automatisation

Elle requiert l'emploi :

  • d'un système piloté par ordinateur d'électrophorèse,
  • de marqueurs fluorescents dont la lumière réfléchie après excitation par un laser est captée par une cellule CCD,
  • d'une suite logicielle permettant l'analyse des signaux sortant de l'appareil et leur mise en forme sous forme de résultats (électrophorégramme et séquence),
  • d'un robot passeur d'échantillon permettant d'enchaîner les échantillons les uns à la suite des autres (notamment passage de plaques de réaction à 96 puits (12×8)).

Séquenceurs à plaques

On fait passer quatre réactions de séquençage (1 pour chaque type de nucléotide) sur 4 lignes différentes ou non.

Séquenceurs capillaires

Un séquenceur de gène capillaire utilise des tubes capillaires de verre de seulement quelques microns de diamètre, sur plusieurs dizaines de centimètres de longueur (30 à 50 cm en général), pour réaliser la séparation des brins d'ADN durant l'électrophorèse.

Les quatre nucléotides passent dans le même tube capillaire. Il faut donc utiliser quatre marqueurs fluorescents différents pour caractériser les quatre nucléotides du brin d'ADN séquencé (adénine, guanine, thymine, cytosine).

Séquenceur monocapillaire

Muni d'un seul capillaire. Une seule migration électrophorétique a lieu à la fois.

Séquenceur multicapillaire

Avec généralement un nombre de capillaires multiple de 2 (2, 4, 8, 16, 96…) On multiplie ainsi le nombre de migrations simultanées, ce qui permet de passer un plus grand nombre d'échantillons dans le même laps de temps.

Constructeurs

Séquenceurs capillaires

Séquenceur haut débit

Depuis 2005 de nouvelles méthodes de séquençage massif ayant en commun le clonage et l'amplification moléculaire ont été développées. Ces méthodes permettent d’amplifier spécifiquement un fragment d’ADN isolé soit dans des microgouttes d’huiles (GS-FLX, Roche) soit par fixation sur lame (Solexa). Les étapes de clonage bactérien particulièrement longues sont ainsi évitées. Trois méthodes utilisent actuellement ce nouveau système :

  • le GS Flex basé sur l'amplification de l'ADN lié spécifiquement à une bille en émulsion et le pyroséquençage (luminescence par libération de pyrophosphate)
  • le Solexa basé sur l'amplification, l’accrochage-liaison sur puce et l'utilisation de terminateurs de chaîne réversibles marqués par des fluorochromes,
  • le SOLiD basé sur l'amplification par émulsion et l'hybridation-ligature chimique.

Ces méthodes offrent de nouvelles perspectives dans de nombreux domaines tels que la génomique médicale (impact majeur dans le diagnostic, les traitements et la prévention des maladies génétiques) et la métagénomique (permettant une approche sans isolement des génomes environnementaux). Cependant, ces avancées posent de nouveaux problèmes dans la compilation, l'étude et la fiabilité des résultats. Il devient donc nécessaire de développer la bio-informatique et ainsi de créer une relation solide entre la théorie et l'expérimentation.

Autres applications

Références

    Articles connexes

    • Portail de la biologie cellulaire et moléculaire
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